
Gam chuẩn RT-PCR: Chẩn đoán cúm & Sởi
Thông tin tài liệu
Chuyên ngành | Sinh học Phân tử/Vi sinh |
Loại tài liệu | Luận án |
Ngôn ngữ | Vietnamese |
Định dạng | |
Dung lượng | 1.94 MB |
Tóm tắt
I.Phát hiện và định lượng virus cúm bằng kỹ thuật RT PCR thời gian thực
Nghiên cứu tập trung vào việc phát triển và ứng dụng phương pháp RT-PCR thời gian thực (real-time RT-PCR) để định lượng nhanh chóng và chính xác virus cúm, đặc biệt là các chủng cúm A/H1N1pdm09, cúm A/H3N2, và cúm B. Phương pháp này cho phép chẩn đoán sớm các bệnh nhiễm cúm và sởi, cũng như đánh giá hiệu quả của vắc xin. Kết quả cho thấy tỷ lệ dương tính với cúm ở những người mắc bệnh đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) tại Hải Dương từ năm 2009-2011, với cúm A/H1N1pdm09 chiếm tỷ lệ đáng kể trong giai đoạn đại dịch năm 2009. Nghiên cứu cũng đề cập đến đồng nhiễm với các virus khác như hRSV và hMPV.
1. Ứng dụng RT PCR thời gian thực trong chẩn đoán cúm
Đoạn văn này nhấn mạnh khả năng của kỹ thuật RT-PCR thời gian thực trong việc chẩn đoán nhanh chóng và chính xác các loại cúm, bao gồm cả cúm A và cúm B. Khả năng xác định phân típ cúm A (ví dụ, A/H1N1, A/H3N2, A/H1N1pdm09) cũng được đề cập. Việc sử dụng RT-PCR không chỉ giúp chẩn đoán cúm mà còn có thể được dùng để chẩn đoán sởi. Để đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả, việc sử dụng gam chuẩn ngoài (chứng dương đã biết nồng độ) là cần thiết. Điều này cho phép kiểm soát chất lượng và định lượng ARN một cách hiệu quả. Tầm quan trọng của việc định lượng chính xác ARN trong việc kiểm soát chất lượng và đánh giá hiệu quả điều trị cũng được nhấn mạnh.
2. Tỷ lệ phát hiện cúm mùa và cúm A H1N1pdm09 tại Hải Dương 2009 2011
Nghiên cứu đã ghi nhận tỷ lệ phát hiện cúm mùa và cúm A/H1N1pdm09 ở bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) nhập viện tại Hải Dương trong giai đoạn 2009-2011. Dữ liệu cụ thể về tỷ lệ nhiễm không được nêu rõ trong đoạn trích này, chỉ đề cập đến việc nghiên cứu đã cung cấp thông tin về tỷ lệ này. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc giám sát dịch tễ học cúm tại các khu vực có mật độ dân số cao và lưu hành cúm mạnh. Việc thu thập dữ liệu về tỷ lệ nhiễm cúm theo thời gian, giới tính, và nhóm tuổi là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về đặc điểm dịch tễ học của cúm, từ đó có các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát hiệu quả hơn. Đoạn văn cũng cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm dịch tễ học của các chủng cúm khác nhau.
3. Đồng nhiễm virus cúm với các tác nhân đường hô hấp khác
Bên cạnh việc phát hiện và định lượng virus cúm, nghiên cứu còn đề cập đến hiện tượng đồng nhiễm cúm với các tác nhân đường hô hấp khác. Cụ thể, việc phát hiện đồng thời virus cúm mùa A (A/H3N2 và A/H1N1), virus cúm B, hRSV (human respiratory syncytial virus), và hMPV (human metapneumovirus) được nhắc đến. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xét nghiệm toàn diện để xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, đặc biệt trong trường hợp bệnh nhân mắc bệnh đường hô hấp nặng. Việc đồng nhiễm có thể gây khó khăn trong việc xác định nguyên nhân chính gây bệnh. Phân tích tỷ lệ đồng nhiễm các loại virus cúm với nhau và với các virus khác góp phần làm rõ hơn cơ chế gây bệnh và sự phức tạp của nhiễm trùng đường hô hấp. Tỷ lệ đồng nhiễm cao nhất là với HRV và hMPV, có thể do sự lưu hành đồng thời của các loại virus này.
4. So sánh kết quả nghiên cứu với các nghiên cứu khác
Kết quả nghiên cứu được so sánh với các nghiên cứu khác, đặc biệt là nghiên cứu của Nguyễn Thu Yến và cộng sự về tỷ lệ dương tính với cúm ở những người mắc bệnh ILI (Influenza-Like Illness), đạt 22%. Mặc dù phương pháp nghiên cứu và định nghĩa trường hợp bệnh khác nhau, nhưng dữ liệu của hai nghiên cứu cho thấy sự tương đồng nhất định, ngoại trừ trường hợp cúm A/H1N1pdm09. Sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm cúm có thể do sự khác nhau trong định nghĩa ca bệnh (ILI so với SARI), phương pháp xét nghiệm, và thời điểm thu thập mẫu. So sánh với tỷ lệ nhiễm cúm trong nghiên cứu về bệnh viêm phổi nặng do virus (SVP), kết quả nghiên cứu này cao hơn, có thể là do định nghĩa ca bệnh chặt chẽ hơn. Những so sánh này giúp làm rõ hơn về sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu và cần phải xem xét thêm các yếu tố liên quan để giải thích sự khác biệt này.
II.Xây dựng phương pháp kiểm định công hiệu vắc xin sởi bằng định lượng ARN
Một phương pháp mới được phát triển để kiểm định công hiệu vắc xin sởi bằng cách định lượng trực tiếp ARN bên trong tế bào bị nhiễm virus. Phương pháp này sử dụng real-time RT-PCR và cho kết quả nhanh chóng chỉ sau 24 giờ, vượt trội so với phương pháp truyền thống PFA (Plaque Forming Assay) mất 9 ngày. Nghiên cứu so sánh hiệu quả của phương pháp mới với PFA, cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa hiệu giá ARN và hiệu giá PFU. Hiệu giá ARN được xác định ổn định và cao hơn hiệu giá PFU khoảng 3000 lần. Việc sử dụng dung dịch TpLR để tách chiết ARN cũng được tối ưu hóa, cho hiệu quả cao hơn và tiết kiệm thời gian.
1. Phương pháp định lượng ARN trực tiếp trong tế bào nhiễm virus
Phần này trình bày phương pháp mới để xác định nhanh công hiệu vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực. Khác với các phương pháp truyền thống, phương pháp này sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để định lượng trực tiếp số lượng ARN của virus sởi bên trong tế bào bị nhiễm sau 24 giờ. Ưu điểm chính của phương pháp này là tốc độ nhanh chóng (24 giờ so với 9 ngày của phương pháp PFA), tính chính xác cao và tự động hóa. Việc định lượng ARN cho phép đánh giá công hiệu vắc xin ở mức độ phân tử, tránh những nhược điểm của phương pháp huyết thanh học truyền thống, đồng thời có thể được áp dụng trong việc kiểm soát chất lượng sản phẩm trong quá trình sản xuất (in process control), một vấn đề chưa có giải pháp hoàn chỉnh cho các vắc xin sống. Nghiên cứu này cũng xem xét kỹ thuật tối ưu hóa điều kiện phản ứng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
2. So sánh với phương pháp PFA Plaque Forming Assay
Phương pháp mới được so sánh với phương pháp truyền thống PFA (Plaque Forming Assay) để đánh giá công hiệu vắc xin. Cả hai phương pháp đều nhằm mục đích đo lường số lượng hạt virus có hoạt tính (khả năng gây nhiễm tế bào), nhưng tín hiệu phát hiện khác nhau: PFA đo ở mức độ tế bào qua sự hình thành các đám hoại tử (sau 9 ngày), trong khi phương pháp mới đo ở mức độ phân tử qua định lượng ARN trong tế bào nhiễm (sau 24 giờ). Phương pháp mới cho thấy hiệu quả vượt trội về thời gian, tránh được các nhược điểm của phương pháp PFA và các xét nghiệm huyết thanh học truyền thống. Nhờ đó, phương pháp này hứa hẹn sẽ giải quyết vấn đề kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất vắc xin sống, một vấn đề nan giải hiện nay. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa hai phương pháp, đặc biệt khi pha loãng vắc xin ở nồng độ 10-1.
3. Kết quả hiệu giá ARN vắc xin sởi thành phẩm và độ ổn định
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa hiệu giá PFU (đo bằng PFA) và hiệu giá ARN (đo bằng real-time RT-PCR) trong 10 lô vắc xin sởi thành phẩm, với độ tương quan cao nhất khi pha loãng vắc xin ở nồng độ 10-1. Sự khác biệt hiệu giá giữa các lô nhỏ hơn 0.41 Log10 và nằm trong khoảng ±2SD, đáp ứng yêu cầu của WHO. Hiệu giá ARN ổn định theo thời gian, cao hơn hiệu giá PFU khoảng 3000 lần. Điều này cho thấy phương pháp định lượng ARN cho phép xác định nhanh chóng (trong vòng 24 giờ) hiệu giá vắc xin sởi ở mức độ phân tử, hiệu giá này rất ổn định và đáng tin cậy. Kết quả này cũng nhất quán với kết quả thử nghiệm trên chủng chuẩn M-0107, chứng minh tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp mới.
4. Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ARN
Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp tách chiết ARN bằng dung dịch TpLR (dung dịch đệm tự pha chứa Tris HCL pH=8, KCL, MgCl2, Nonidet-P40, và Tween 20). Phương pháp này cho phép thu được nhiều mẫu hơn (300µl so với 60µl) và tiết kiệm thời gian, công sức, và chi phí so với các phương pháp khác. Hiệu giá ARN vẫn không có sự khác biệt đáng kể sau 1 năm bảo quản ở -80 độ C. Việc sử dụng TpLR để xử lý ARN bên trong tế bào phức tạp hơn so với xử lý ARN trong dịch nổi, nhưng lại cho phép đọc kết quả sớm hơn. Kết quả cũng cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa phương pháp tách chiết ARN bằng TpLR với các phương pháp tách chiết thương mại, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu. Thêm nữa, khi sử dụng TpLR ở nồng độ pha loãng vắc xin 10-1, các chất ức chế trong vắc xin có thể không ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của virus.
III.Sản xuất chứng dương ARN và ứng dụng trong kiểm định chất lượng
Nghiên cứu đã thành công trong việc sản xuất chứng dương ARN bằng kỹ thuật phiên mã in vitro. Những chứng dương này có chất lượng cao, định lượng được, và ổn định trong thời gian dài (ít nhất 4 năm), đáp ứng nhu cầu cho việc kiểm định chất lượng và định lượng trong các xét nghiệm sinh học phân tử. Chúng có thể được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và chương trình đánh giá chất lượng bên ngoài (EQA NAT).
1. Phương pháp sản xuất chứng dương ARN bằng phiên mã in vitro
Phần này mô tả quá trình sản xuất chứng dương ARN bằng kỹ thuật phiên mã in vitro, sử dụng hệ thống T7RiboMAX™. Quá trình này cho phép tạo ra ARN đồng nhất, tinh khiết, định lượng được, an toàn và có sản lượng cao. Cơ chế phiên mã in vitro cổ điển được đề cập, nhấn mạnh vào việc sử dụng trình tự chức năng phiên mã T7 của vector và kỹ thuật RFLP để tạo ra sản phẩm ARN có chiều dài đồng nhất. Sản lượng ARN đạt được rất cao, dao động từ 1,59x10^11 đến 1,2x10^19 bản sao, đảm bảo sử dụng trong thời gian dài (ít nhất 4 năm, mặc dù số liệu cụ thể không được nêu trong nghiên cứu). Việc phá hủy khuôn mẫu ADN sau phiên mã được kiểm tra kỹ lưỡng bằng RT-PCR để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Phương pháp này cho thấy hiệu quả cao và ổn định, phù hợp để sản xuất chứng dương ARN với số lượng lớn phục vụ cho nhiều ứng dụng.
2. Ứng dụng chứng dương ARN trong kiểm định chất lượng và chẩn đoán
Chứng dương ARN được sản xuất có nhiều ứng dụng quan trọng. Đầu tiên, chúng được sử dụng như gam chuẩn ngoài (external standard) trong các xét nghiệm định lượng ARN, giúp kiểm soát chất lượng và độ chính xác của kết quả. Thứ hai, ARN tổng hợp có thể được sử dụng trong chẩn đoán bệnh, cung cấp nguồn vật liệu chuẩn xác và ổn định. Ngoài ra, nghiên cứu đề cập đến tiềm năng sử dụng chứng dương ARN để sản xuất các bộ mẫu chuẩn (panel) cho chương trình đánh giá chất lượng bên ngoài trong xét nghiệm acid nucleic (External quality assessment for nucleic acid testing - EQA NAT). Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc sản xuất chứng dương ARN chất lượng cao trong việc nâng cao chất lượng chẩn đoán và kiểm soát chất lượng xét nghiệm sinh học phân tử ở Việt Nam. Độ nhạy của phương pháp sử dụng TaqMan, một kỹ thuật phổ biến trong real-time PCR, cũng được đề cập.
IV.Đặc điểm dịch tễ học cúm tại Việt Nam
Nghiên cứu mô tả dịch tễ học cúm tại Việt Nam, đặc biệt là tại Hải Dương. Tỷ lệ nhiễm cúm khác nhau giữa các năm, ảnh hưởng bởi các yếu tố như đại dịch cúm A/H1N1pdm09 năm 2009. Nhóm tuổi dễ mắc cúm cũng khác nhau tùy thuộc vào chủng virus. Nghiên cứu của Nguyễn Thu Yến và cộng sự (2011) về tỷ lệ dương tính với cúm trong quần thể ILI (22%) được so sánh với kết quả nghiên cứu này. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Trần Hiển, Nguyễn Thị Thường và cộng sự (2011) về bệnh nhiễm trùng hô hấp cấp tính nặng (SARI) ở miền Bắc Việt Nam cũng được nhắc đến.
1. Tỷ lệ nhiễm cúm tại Việt Nam và so sánh quốc tế
Tài liệu chỉ ra Việt Nam là một trong những điểm nóng về lưu hành cúm, bao gồm cả chủng A/H1N1pdm09. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Yến và cộng sự, tỷ lệ dương tính với cúm ở những người mắc bệnh ILI (Influenza-Like Illness) tại Việt Nam, được chẩn đoán bằng RT-PCR, là 22%. Tỷ lệ này tương đối đồng nhất giữa các cơ sở y tế và các vùng miền (20-23%). Cúm B lưu hành quanh năm. Để so sánh, tỷ lệ dương tính với cúm A ở Lào vào mùa đông-xuân là 9%, trong khi tại Hoa Kỳ và Pháp, tỷ lệ này dao động từ 5-20% và 5-15% tương ứng, cho thấy tỷ lệ nhiễm cúm tại Việt Nam tương đối cao so với một số quốc gia khác. Sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm cúm giữa các quốc gia có thể do nhiều yếu tố, bao gồm sự khác biệt về khí hậu, hệ thống y tế, và các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh. Nghiên cứu cần được mở rộng để hiểu rõ hơn về sự khác biệt này.
2. Đặc điểm lưu hành của các chủng cúm A tại Việt Nam
Tại Việt Nam, thường chỉ có một chủng cúm A nổi trội mỗi năm (A/H1N1 hoặc A/H3N2). Điều này được phản ánh qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Yến và cộng sự. Sự lưu hành của cúm B diễn ra quanh năm và không có mối liên hệ rõ ràng với các phân típ cúm A. Dữ liệu về tỷ lệ nhiễm cúm A/H1N1pdm09 trong giai đoạn 2009-2011 tại Hải Dương cho thấy sự biến động đáng kể, cao nhất vào năm 2009 (giai đoạn đại dịch) và giảm mạnh vào các năm sau đó. Sự suy giảm này có thể do sự hình thành miễn dịch cộng đồng sau đại dịch hoặc do sự cạnh tranh giữa các chủng virus. Sự hiểu biết về đặc điểm lưu hành của các chủng cúm khác nhau là rất quan trọng để phát triển các chiến lược phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.
3. Nghiên cứu về cúm tại Việt Nam
Các nghiên cứu về cúm tại Việt Nam được tiến hành đa dạng, bao gồm chẩn đoán, huyết thanh học, sinh học phân tử, miễn dịch học, mô hình toán học, sản xuất vắc xin, đánh giá tính nhạy cảm với thuốc kháng virus (oseltamivir), và giám sát trọng điểm hội chứng cúm (ILI) và viêm phổi nặng do virus (SVP). Việc giám sát trọng điểm ILI cho thấy tỷ lệ dương tính với cúm là 22%, cao hơn so với kết quả nghiên cứu đề cập trong tài liệu. Sự khác biệt này có thể do định nghĩa ca bệnh khác nhau. Sự đa dạng trong các hướng nghiên cứu cho thấy sự quan tâm và nỗ lực của các nhà khoa học Việt Nam trong việc hiểu rõ hơn về bệnh cúm và phát triển các giải pháp phòng chống bệnh. Thử nghiệm lâm sàng cũng là một phần quan trọng trong nghiên cứu cúm để đánh giá hiệu quả của các phương pháp điều trị và vắc xin.