PCR Real-time: Kỹ thuật chẩn đoán

Phần này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tuân thủ nghiêm ngặt quy trình kỹ thuật trong từng bước của xét nghiệm PCR và real-time PCR, từ khâu lấy mẫu đến khi báo cáo kết quả. Mỗi giai đoạn đều tiềm ẩn những vấn đề kỹ thuật cần được người lấy mẫu, người thực hiện xét nghiệm và người sử dụng kết quả hết sức lưu tâm. Việc sử dụng vật liệu lấy và bảo quản mẫu cũng được đề cập, với khuyến cáo nên sử dụng vật liệu tinh sạch sinh học, dùng một lần để tránh nhiễm bẩn và phân hủy nucleic acid của tác nhân đích. Công ty Nam Khoa được nhắc đến là nhà cung cấp các vật liệu này. Đạt được độ chính xác cao và độ nhạy tuyệt vời của PCR và real-time PCR phụ thuộc rất nhiều vào sự cẩn trọng trong từng bước thực hiện, đảm bảo kết quả xét nghiệm kịp thời và chính xác đến tay người chỉ định.

Lấy mẫu đúng vị trí là yếu tố quyết định thành công của xét nghiệm. Ví dụ, để phát hiện M. tuberculosis gây lao phổi, mẫu cần lấy là đàm hoặc dịch rửa khí quản, không phải máu hay huyết thanh. Tương tự, phát hiện Cytomegalovirus tốt nhất bằng máu toàn phần để tách huyết tương hoặc bạch cầu, không dùng máu đông. Bảo quản và vận chuyển mẫu cần đảm bảo nguyên trạng, nucleic acid của tác nhân đích không bị phân hủy. DNA có thể bảo quản ngắn hạn (48 giờ) ở 2-8°C, và lâu dài ở -18°C đến -30°C. RNA, tùy loại mẫu, có thể bảo quản tương tự, nhưng cần lưu ý nguy cơ nhiễm tạp. Mục tiêu cuối cùng là lấy mẫu đúng vị trí, bảo quản và vận chuyển mẫu đúng cách để tránh phân hủy nucleic acid, nhiễm bẩn sinh học và nhiễm chéo.

Khâu tách chiết nucleic acid cần tối đa hóa việc thu nhận nucleic acid đích, ngay cả khi lượng rất nhỏ và bị pha loãng. Sản phẩm tách chiết phải tinh khiết, không lẫn protein hay chất ức chế phản ứng khuếch đại. Phương pháp tách chiết cần được lựa chọn phù hợp với loại mẫu, tác nhân đích (vi khuẩn, virus, nấm…) và loại nucleic acid (DNA hay RNA). Ví dụ, phương pháp Boom hiệu quả với dịch sinh học nhưng kém hiệu quả với mô sinh thiết, trong khi phenol/chloroform lại thích hợp hơn cho mô sinh thiết. Kiểm tra độ nhạy của bộ tách chiết là cần thiết, bằng cách thử nghiệm trên các độ pha loãng của tác nhân đích, đạt đến giới hạn phát hiện (LOD). Sản phẩm NK DNAPREP-BOOM được nhắc đến như một ví dụ về bộ tách chiết đạt chất lượng.

Mặc dù PCR/real-time PCR có độ nhạy cao về nguyên tắc, nhưng trên thực tế, độ nhạy phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thiết kế mồi, thiết bị luân nhiệt, hóa chất và đặc biệt là enzyme Taq polymerase. Để đảm bảo độ nhạy, cần kiểm tra độ nhạy của PCR mix trước khi sử dụng, bằng cách thử nghiệm trên các độ pha loãng của DNA đích đã biết số lượng copy. PCR mix đạt độ nhạy khi đạt được giới hạn phát hiện (LOD), tức là phát hiện được một copy DNA đích. Kiểm soát chất lượng PCR mix trong mỗi lần xét nghiệm bằng chứng dương (+), chứng âm (-), và chứng nội tại, giúp kiểm soát ức chế PCR và độ nhạy của PCR mix. Chất lượng của Taq polymerase đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ nhạy của PCR mix trong quá trình bảo quản.

Nhiễm chéo và ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại là những nguy cơ gây kết quả dương tính giả trong xét nghiệm PCR. Nhiễm chéo có thể phòng ngừa bằng cách bố trí phòng thí nghiệm hợp lý, thao tác vô trùng kỹ lưỡng. Tuy nhiên, ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại khó tránh hoàn toàn bằng các biện pháp kỹ thuật thông thường. Giải pháp hiệu quả nhất là sử dụng PCR mix có pha thêm dUTP và UNG để loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại.

Điện di trên thạch agarose là phương pháp phổ biến để đọc kết quả PCR. Để đảm bảo kết quả chính xác, cần chú ý đến các yếu tố sau: bề mặt khuôn điện di phải phẳng, không trộn đệm tải với sản phẩm PCR trên giấy paraffin để tránh nhiễm chéo, gel agarose phải được hòa tan hoàn toàn trong đệm điện di, kiểm tra chất lượng điện di bằng thang DNA, sử dụng chứng dương (+) và chứng âm (-) để kiểm soát ngoại nhiễm, thay đệm điện di thường xuyên. Ethidium bromide, mặc dù hiệu quả, nhưng có độc tính, nên cân nhắc sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang an toàn hơn như SYBR Safe, GelRed hoặc GelGreen.

Ethidium bromide (EB) là chất nhuộm huỳnh quang DNA hiệu quả nhưng có độc tính cao. Khi thao tác với EB, cần tuân thủ các biện pháp an toàn: đeo găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ; xử lý dụng cụ tiếp xúc với EB đúng cách; sử dụng que xúc bằng nhựa; sử dụng giấy thấm để tránh làm rơi vãi EB. Việc này nhằm bảo vệ sức khỏe người thao tác và môi trường phòng thí nghiệm.

Chứng nội tại (IC) là DNA được khuếch đại song song với DNA đích, giúp kiểm soát chất lượng xét nghiệm. IC có thể có kích thước khác hoặc trình tự khác DNA đích. IC có nguồn gốc từ DNA vật chủ giúp kiểm soát mẫu thử, hệ thống tách chiết nucleic acid và hiện tượng ức chế PCR. IC tổng hợp dựa trên DNA đích, sử dụng cùng mồi với DNA đích, giúp kiểm soát hệ thống khuếch đại. IC có nguồn gốc khác biệt với DNA đích, dùng mồi khác biệt, giúp kiểm soát ức chế PCR và độ nhạy của hệ thống khuếch đại. Sử dụng chứng nội tại giúp phân biệt âm tính thật hay âm tính giả do ức chế.

Bài viết nhấn mạnh việc sử dụng mẫu chuẩn trong real-time PCR định lượng để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Mẫu chuẩn phải cho kết quả tuyến tính cao với hiệu quả PCR tuyệt đối, kiểm soát thao tác pipetting của người thực hiện. Kết quả định lượng chỉ được coi là khác biệt khi sự khác biệt giữa hai lần thử là trên hoặc bằng 100 lần (2 log₁₀). Để tránh hiểu lầm, kết quả nên được trình bày dưới dạng log₁₀ thay vì số lượng copy chính xác. Việc thực hiện xét nghiệm định lượng cần có khoảng thời gian hợp lý để đảm bảo đánh giá hiệu quả điều trị chính xác.

Kết quả xét nghiệm PCR/real-time PCR chỉ được coi là chuẩn mực khi báo cáo kết quả thể hiện đầy đủ các bước kiểm soát chất lượng đã được thực hiện. Kết quả dương tính (+) không tự động đồng nghĩa với việc người bệnh nhiễm tác nhân gây bệnh, cần kết hợp với các xét nghiệm khác để chẩn đoán chính xác. Ví dụ, kết quả PCR dương tính cho M. tuberculosis cần được xác nhận bằng X-quang phổi để chẩn đoán bệnh lao.

PCR/real-time PCR là công cụ chẩn đoán mạnh mẽ với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng kết quả phụ thuộc vào kiến thức của người sử dụng và người chỉ định xét nghiệm. Bài viết minh họa một số trường hợp sử dụng kết quả PCR/real-time PCR để phát hiện tác nhân vi sinh gây bệnh, ví dụ HBV-DNA (-) trên bệnh nhân HBsAg (+). Hiểu rõ cách giải thích kết quả real-time PCR định lượng, đặc biệt là ý nghĩa của sự khác biệt 2 log₁₀ giữa các lần xét nghiệm, là rất quan trọng để đánh giá hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm virus.

Phòng thí nghiệm chẩn đoán có nhiệm vụ chính là thực hiện các xét nghiệm trên mẫu thử để phát hiện tác nhân gây bệnh và trả lời kết quả cho người gửi yêu cầu. Kết quả này đóng vai trò then chốt trong việc ra quyết định của các cơ quan chức năng, ví dụ như tiêu hủy hay cách ly đàn gia súc bị nhiễm bệnh trong chăn nuôi, hay thủy sản. Trong y học, phòng thí nghiệm chẩn đoán (hay phòng thí nghiệm lâm sàng) cung cấp kết quả xét nghiệm cho các bác sĩ để đưa ra phác đồ điều trị. Do đó, phòng thí nghiệm chẩn đoán cần đảm bảo kết quả chính xác và kịp thời.

Trái ngược với phòng thí nghiệm chẩn đoán, phòng thí nghiệm nghiên cứu thực hiện các thử nghiệm để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu khoa học. Mục tiêu là giúp các nhà nghiên cứu giải đáp các vấn đề khoa học. Kết quả nghiên cứu không liên quan trực tiếp và tức thời đến quyết định của người gửi mẫu. Trong lĩnh vực chăn nuôi, thủy sản, kết quả không ảnh hưởng đến quyết định tiêu hủy hay cô lập đàn vật nuôi. Tương tự trong y học, kết quả không trực tiếp liên quan đến quyết định điều trị của bác sĩ. Vì vậy, tính chất kịp thời của kết quả không phải là yêu cầu bắt buộc đối với phòng thí nghiệm nghiên cứu.

Sự khác biệt cơ bản nằm ở mục đích và tính chất của hai loại phòng thí nghiệm. Phòng thí nghiệm chẩn đoán phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh và hỗ trợ điều trị hoặc kiểm soát dịch bệnh, đòi hỏi kết quả nhanh chóng và chính xác. Phòng thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào việc khám phá khoa học, kết quả không nhất thiết phải kịp thời, mà sự chính xác và độ tin cậy vẫn là yếu tố quan trọng. Sự khác biệt này dẫn đến các yêu cầu khác nhau về quy trình, thiết bị, và thời gian hoàn thành xét nghiệm giữa hai loại phòng thí nghiệm.

Để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của kết quả xét nghiệm PCR/Real-time PCR, việc sử dụng các chứng chuẩn là điều không thể thiếu. Các chứng chuẩn bao gồm chứng dương (+), chứng âm (-), và chứng nội tại (Internal Control - IC). Chứng dương (+) xác nhận khả năng khuếch đại của hệ thống, chứng âm (-) kiểm tra sự nhiễm bẩn của thuốc thử và môi trường. Chứng nội tại, tùy thuộc vào thiết kế, có thể kiểm soát sự ức chế PCR, độ nhạy của hệ thống tách chiết, hoặc cả hệ thống khuếch đại. Việc sử dụng các chứng chuẩn này giúp phát hiện sớm các sai sót trong quy trình, từ khâu lấy mẫu, tách chiết đến khuếch đại, đảm bảo độ chính xác của kết quả cuối cùng. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các xét nghiệm PCR định lượng, nơi mà độ chính xác của kết quả là yếu tố then chốt.

Trong xét nghiệm real-time PCR định lượng, việc sử dụng mẫu chuẩn cùng với mẫu bệnh phẩm là rất cần thiết. Mẫu chuẩn giúp xây dựng đường chuẩn để tính toán chính xác số lượng bản sao ban đầu của mẫu thử. Đồng thời, qua các thông số như hệ số tương quan (R) và hiệu quả PCR (E), ta có thể đánh giá chất lượng thao tác pipetting của người thực hiện. Một đường chuẩn lý tưởng có hệ số tương quan R ≥ 0.990 và hiệu quả PCR (E) từ 90% đến 105%. Việc kiểm soát chặt chẽ các thông số này giúp đảm bảo tính chính xác của kết quả định lượng, tránh sai sót do thao tác pipetting không chuẩn xác. Một số công ty cung cấp mẫu chuẩn đã được pha sẵn vào PCR mix, điều này làm giảm khả năng kiểm soát chất lượng thao tác pipetting.

Một báo cáo kết quả PCR/Real-time PCR chuẩn mực cần phải minh bạch và thể hiện đầy đủ các bước kiểm soát chất lượng đã được thực hiện. Điều này bao gồm việc ghi nhận kết quả của các chứng chuẩn (chứng dương, chứng âm, chứng nội tại) và giải thích các sai lệch nếu có. Đối với xét nghiệm real-time PCR định lượng, kết quả nên được trình bày dưới dạng log₁₀ để tránh nhầm lẫn và đánh giá sai về sự khác biệt giữa các lần xét nghiệm. Sự khác biệt có ý nghĩa thường được định nghĩa là ≥ 2 log₁₀. Kết quả PCR dương tính (+) chỉ là một phần của quá trình chẩn đoán, cần phải kết hợp với các xét nghiệm và đánh giá lâm sàng khác để đưa ra chẩn đoán chính xác. Việc hiểu rõ những điểm này là rất quan trọng để tránh những hiểu lầm trong việc sử dụng kết quả xét nghiệm.

Phòng điện di, nơi thực hiện điện di và đọc kết quả điện di, cần được trang bị đầy đủ các thiết bị và dụng cụ cần thiết. Một buồng thao tác điện di, tối thiểu đủ cho một người làm việc, cần có: máy vortex, bộ điện di agarose minigel (ít nhất 2 bộ), máy ly tâm compact, micropipette 1-20µl, hộp đựng gel đã dùng và đang dùng, hộp đựng đầu pipette đã dùng. Buồng thao tác cần đảm bảo môi trường sạch sẽ và có đầy đủ ánh sáng, bao gồm cả đèn cực tím để quan sát kết quả điện di. Việc sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang an toàn như SYBR Safe, GelRed, hay GelGreen thay thế cho Ethidium bromide cũng được khuyến khích để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Phòng thao tác PCR cần trang bị đầy đủ các thiết bị và dụng cụ để đảm bảo quá trình thực hiện PCR diễn ra chính xác và an toàn. Buồng thao tác PCR, tối thiểu cho hai người làm việc, cần có: máy vortex (2 máy), máy ủ nhiệt khô (2 máy), máy hút chân không, micropipette (1000µl x 2, 20-200µl x 2, 1-20µl x 1), và các lọ đựng vật liệu dơ, nhiễm. Tương tự như phòng điện di, buồng thao tác PCR cũng cần đảm bảo môi trường sạch sẽ, có đầy đủ ánh sáng, và được thiết kế để tránh nhiễm chéo giữa các mẫu và thuốc thử. Việc này đặc biệt quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả PCR.

Để tránh nhiễm chéo và đảm bảo chất lượng xét nghiệm, phòng điện di đọc kết quả nên được tách biệt hoặc chỉ thông với phòng đặt máy PCR/real-time PCR. Sự tách biệt này giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn chéo giữa các mẫu và sản phẩm PCR. Một thiết kế phòng thí nghiệm hợp lý sẽ giúp tối ưu hóa quy trình làm việc, tăng hiệu quả và độ chính xác của kết quả xét nghiệm.

Phòng pha chế thuốc thử PCR và real-time PCR chỉ cần thiết cho các phòng thí nghiệm chẩn đoán lớn và cần được tách biệt hoàn toàn với các phòng khác. Trước khi vào phòng, người làm việc cần thay áo chuyên dụng chỉ dùng trong phòng này. Tất cả các thiết bị, hoá chất, dụng cụ pha chế chỉ được sử dụng trong phòng và không được mang ra ngoài. Môi trường phòng cần được đảm bảo sạch sẽ và tinh khiết. Các thiết bị và dụng cụ cần thiết sẽ được quyết định tùy thuộc vào quy mô và nhu cầu của phòng thí nghiệm.